Protocol下载
概要
巨噬细胞是一类固有免疫细胞，在机体应对感染或组织损伤的炎症反应中发挥重要作用，同时在炎症消退过程中同样具有关键功能。巨噬细胞主导调控固有免疫应答及后续适应性免疫应答。为行使各类生理功能，巨噬细胞可根据局部微环境变化，分化形成多种特征各异但功能存在重叠的活化状态。
干扰素 γ（IFNγ）、脂多糖（LPS）等刺激因子可诱导巨噬细胞发生促炎活化，伴随活性氧、促炎细胞因子及趋化因子的生成。免疫复合物与脂多糖可诱导巨噬细胞进入抗炎活化状态，避免机体组织受到损伤；该状态下细胞高表达抗炎细胞因子 IL-10，同时低表达促炎细胞因子。创伤修复型巨噬细胞可被 IL-4 或 IL-13 激活，参与组织重塑与炎症消退过程。
巨噬细胞几乎分布于机体所有组织中，对维持机体稳态至关重要；而巨噬细胞功能异常也会诱发炎症性肠病等各类疾病。为研究巨噬细胞在复杂体内环境中的作用，常采用细胞清除与重建实验模型。
氯膦酸脂质体是体内清除巨噬细胞高效且通用的工具，可靶向特异性清除目标组织中的巨噬细胞，也可应用于转基因小鼠实验。但氯膦酸脂质体会无差别清除所有亚型巨噬细胞及有可能清除某些病理模型下的亚型树突状细胞，因此需要联合其他实验策略，以明确生理效应是由整体巨噬细胞还是特定活化表型的巨噬细胞所介导。
可通过过继转移方式重建巨噬细胞，无论是否预先清除内源巨噬细胞，均可进一步验证所观测的生物学效应是否依赖巨噬细胞。将体外活化的巨噬细胞或转基因小鼠来源的巨噬细胞过继转移至疾病模型中，可探究特定蛋白分子或活化状态是否影响疾病进程。本章研究证实：联合使用氯膦酸脂质体清除巨噬细胞与巨噬细胞重建实验，能够有效解析巨噬细胞在生理稳态及疾病发生发展中的作用。
Experimental workflow for clodronate liposome‑mediated specific macrophage depletion and reconstitution in mice
背景
巨噬细胞是具有吞噬功能的固有免疫细胞，在调控固有免疫与适应性免疫应答中发挥重要作用。这类关键免疫细胞参与免疫应答的全过程，包括炎症的识别、应答及消退。巨噬细胞的一大核心特征是可塑性，即能够感知局部微环境信号、改变自身表型，进而做出适宜的免疫应答。因此，巨噬细胞属于异质性细胞群，拥有多种彼此独立但功能存在重叠的活化状态，这也增加了其在体研究的难度 [1]。
目前已有三种研究最为成熟的巨噬细胞活化状态，可通过体外给予外源刺激进行模型构建。经干扰素 γ（IFNγ）预处理、再经 Toll 样受体（TLR）激动剂（如细菌脂多糖 LPS）活化的巨噬细胞，被定义为 M (IFNγ+LPS)；该类细胞可分泌促炎细胞因子与趋化因子，在机体抵御病原体的防御过程中至关重要 [2]。
巨噬细胞同样承担终止免疫应答的重要功能，避免宿主组织遭受免疫损伤 [3]。体外可构建具有免疫抑制表型的巨噬细胞模型：经免疫复合物（Ic）或多克隆 IgG 静脉注射免疫球蛋白（IVIg）诱导，分别得到 M (Ic) 与 M (IVIg)。即便受到 LPS 等典型促炎刺激，这类细胞仍可高分泌抗炎因子 IL-10，同时低表达促炎细胞因子 [4,5]。
为修复炎症造成的组织损伤，巨噬细胞可转变为创伤修复表型；体外可通过 IL-4 或 IL-13 诱导获得 M (IL-4)、M (IL-13) 模型 [6]。相较于 M (IFNγ+LPS)，创伤修复型巨噬细胞在 TLR 激活后，促炎因子分泌水平更低、IL-10 分泌更高 [7]。但 M (Ic) 与 M (IL-4) 表型存在明显差异：M (Ic) 不参与细胞外基质生成，也不表达 M (IL-4) 的标志性功能蛋白，如精氨酸酶 1（Arg1）、Ym1 [8]。
巨噬细胞的功能具有双重性，发挥保护作用或致病作用完全取决于其活化状态。例如，促炎型巨噬细胞可杀伤肿瘤细胞，也可通过创伤修复或免疫抑制机制促进肿瘤生长 [9]。在肠道中，巨噬细胞可摄取肠腔内容物，诱导机体对肠道共生菌产生免疫耐受[10]；反之，若对肠道共生菌产生过度炎症应答，则会诱发炎症性肠病（IBD）相关炎症；而过度的组织修复反应又会导致 IBD 伴随的组织纤维化 [10]。
若在小鼠体内研究巨噬细胞功能，可采用氯膦酸脂质体进行细胞清除实验。氯膦酸是一种亲水性小分子双膦酸盐，被包裹进脂质体后，可被巨噬细胞、部分树突状细胞等专职吞噬细胞内吞 [11]。进入细胞后，溶酶体磷脂酶会将脂质体中的氯膦酸释放至胞质，最终诱导巨噬细胞发生程序性凋亡（细胞自杀）[12]。
氯膦酸难以穿透脂质体磷脂双分子层，因此对非吞噬细胞毒性极低 [11]。相较于其他手段，氯膦酸脂质体清除巨噬细胞具备成本低、操作简便、效果稳定、适用于转基因小鼠等优势。此外，也可利用CD11b-DTR或CD11c-DTR转基因小鼠模型，经白喉毒素处理后特异性清除表达 CD11b 或 CD11c 的细胞。但该方法成本高、实验周期长，若需与其他基因修饰小鼠杂交建模则更为耗时。
氯膦酸脂质体已应用于脑切片体外培养实验，证实小胶质细胞对中枢神经系统稳态维持至关重要，并参与调控发育神经元凋亡与突触发生过程 [13]。同时也被用于小鼠 AOM-DSS 结直肠癌模型，研究发现巨噬细胞可促进肿瘤发生、改变肠道菌群结构 [14]。本实验室在 SHIP 基因缺陷小鼠中使用氯膦酸脂质体，证实巨噬细胞参与小鼠自发性回肠炎的发生发展 [15]。
目前氯膦酸脂质体也已进入人体临床试验，用于类风湿关节炎等疾病，可短暂抑制滑膜巨噬细胞活性 [16]。虽然利用氯膦酸脂质体可明确巨噬细胞在组织稳态与疾病中的整体作用，但无法区分不同活化亚型巨噬细胞的功能贡献 [17]。
给药途径、剂量及注射时机均会影响巨噬细胞的清除效率，不同给药方式可达到不同清除水平。例如：静脉注射氯膦酸脂质体可清除肠道固有层近 90% 的巨噬细胞；腹腔注射清除率约为 50%[18-20]。局部给药可实现组织特异性清除，如经气管、直肠、睾丸局部给药，靶向清除组织原位巨噬细胞 [12]。
提高给药剂量可进一步提升清除效率；如需单次给药达到最大作用剂量，优先选择腹腔注射而非静脉注射。长期疾病模型往往需要多次注射，以维持稳定、长效的巨噬细胞清除效果。在 DSS 诱导结肠炎等炎症疾病模型中，需在炎症发生前及炎症进展期持续给药，同时清除组织原位巨噬细胞与浸润性巨噬细胞 [17]。
实验需设置 PBS 对照组与 PBS 空白脂质体对照组；但已有研究报道，部分实验条件下 PBS 脂质体本身也会轻微清除巨噬细胞 [18,20]，还可能短暂抑制细胞吞噬功能，因此必须通过实验验证 PBS 脂质体是否适合作为阴性对照 [11]。同时需通过组织学染色或流式细胞术，验证氯膦酸脂质体的巨噬细胞清除效率，并与 PBS、PBS 脂质体对照组进行比对。
由于氯膦酸脂质体会清除所有专职吞噬细胞（并非仅靶向巨噬细胞），需同步开展巨噬细胞重建实验，以确认观测到的生物学效应具有巨噬细胞特异性。通过过继转移骨髓来源巨噬细胞进行细胞重建，还可探究特定巨噬细胞活化表型对疾病进程的调控作用 [17]。
例如在 DSS 结肠炎模型中，过继转移 M (IL-4) 型巨噬细胞可缓解炎症，而未活化巨噬细胞或 M (IFNγ) 型则无此保护效应 [17]。重建实验可结合转基因小鼠，用于验证特定基因表达是否介导巨噬细胞的功能效应。本课题组利用该策略证实：在 PI3Kp110δ 缺陷小鼠 DSS 结肠炎模型中，Arg1 的表达是 M (IL-4) 巨噬细胞发挥抗炎保护作用的必要条件 [21]。
巨噬细胞重建多采用静脉注射方式，腹腔注射同样可实现高效回输 [21,22]。可通过 PKH26 荧光染料标记、或采用 GFP 报告小鼠来源巨噬细胞，追踪过继细胞在体内的分布与存活 [21,23]。
巨噬细胞具有微环境响应特性，体外诱导的活化表型进入体内新微环境后可能发生表型重编程。即便如此，仍可在疾病造模前回输巨噬细胞，探究其预防疾病发生的作用；或在疾病进程中回输，评估其干预疾病自然进展的效果。也可先清除小鼠自身原位及浸润巨噬细胞，再进行细胞回输，提高移植巨噬细胞的定植效率。
本文系统介绍了小鼠巨噬细胞功能研究的成熟实验体系；本章详细阐述了氯膦酸脂质体介导的巨噬细胞清除方法，以及骨髓来源巨噬细胞的制备与过继重建方案。该实验方案适用于多种疾病模型，且可与各类转基因小鼠联用。
参考文献
1.Murray PJ, Wynn TA. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 2011;11:723-737
2.Martinez FO, Gordon S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 2014;6:13
3.Fleming BD, Mosser DM. Regulatory macrophages: setting the threshold for therapy. Eur J Immunol. 2011;41:2498-2502
4.Sutterwala FS, Noel GJ, Salgame P, et al. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 1998;188:217-222
5.Kozicky LK, Zhao ZY, Menzies SC, et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 2015;98:983-994
6.Gordon S. Alternative activation of macrophages. Nat Rev Immunol. 2003;3:23-35
7.Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014;41:14-20
8.Edwards JP, Zhang X, Frauwirth KA, et al. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 2006;80:1298-1307
9.Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 2008;8:958-969
10.Heinsbroek SE, Gordon S. The role of macrophages in inflammatory bowel diseases. Expert Rev Mol Med. 2009;11:e14
11.Van Rooijen N, Sanders A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J Immunol Methods. 1994;174:83-93
12.van Rooijen N, Hendrikx E. Liposomes for specific depletion of macrophages from organs and tissues. Methods Mol Biol. 2010;605:189-203
13.Marín-Teva JL, Dusart I, Colin C, et al. Microglia promote the death of developing Purkinje cells. Neuron. 2004;41:535-547
14.Bader JE, Enos RT, Velázquez KT, et al. Macrophage depletion using clodronate liposomes decreases tumorigenesis and alters gut microbiota in the AOM/DSS mouse model of colon cancer. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2018;314:G22-G31
15.Ngoh EN, Weisser SB, Lo Y, et al. Activity of SHIP, which prevents expression of interleukin 1β, is reduced in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology. 2016;150:465-476
16.Barrera P, Blom A, van Lent PL, et al. Synovial macrophage depletion with clodronate-containing liposomes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2000;43:1951-1959
17.Weisser SB, van Rooijen N, Sly LM. Depletion and reconstitution of macrophages in mice. J Vis Exp. 2012;66:4105
18.Weisser SB, Brugger HK, Voglmaier NS, et al. SHIP-deficient, alternatively activated macrophages protect mice during DSS-induced colitis. J Leukoc Biol. 2011;90:483-492
19.Smith P, Mangan NE, Walsh CM, et al. Infection with a helminth parasite prevents experimental colitis via a macrophage-mediated mechanism. J Immunol. 2007;178:4557-4566
20.Qualls JE, Kaplan AM, van Rooijen N, et al. Suppression of experimental colitis by intestinal mononuclear phagocytes. J Leukoc Biol. 2006;80:802-815
21.Weisser SB, Kozicky LK, Brugger HK, et al. Arginase activity in alternatively activated macrophages protects PI3Kp110δ deficient mice from dextran sodium sulfate induced intestinal inflammation. Eur J Immunol. 2014;44:3353-3367
22.Potts BE, Hart ML, Snyder LL, et al. Differentiation of C2D macrophage cells after adoptive transfer. Clin Vaccine Immunol. 2008;15:243-252
23.McNeill E, Iqbal AJ, Jones D, et al. Tracking monocyte recruitment and macrophage accumulation in atherosclerotic plaque progression using a novel hCD68GFP/ApoE−/− reporter mouse-brief report Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2017;37:258-263
24.Weisser SB, McLarren KW, Kuroda E, et al. Generation and characterization of murine alternatively activated macrophages. Methods Mol Biol. 2013;946:225-239
